超临界流体色谱法在手性化合物分离制备中的应用

超临界流体色谱法在手性化合物分离制备中的应用

20 世纪 50 至 60 年代,著名的 「反应停事件」致使全世界诞生了约 1.2 万名海豹肢畸形儿,引起了世界各地相关专家学者对手性结构拆分及鉴定的广泛关注。同时,这一事件也促使美国 FDA 加强了对新药申报资料中关于手性研究数据提交的严格要求,数据要求包括纯对映体或消旋体的拆分方法、药效及毒副作用的考察研究等。由于手性结构在安全有效用药中的重要影响,快速高效的手性结构分离方法在药物研发过程中更是不可缺少的重要环节。 

手性拆分方法多种多样,而色谱拆分法为目前的主流拆分方法。色谱拆分方法又分为薄层色谱法 (TLC)、气相色谱法 (GC)、高效毛细管电泳 (HPCE)、液相色谱法 (HPLC) 及超临界流体色谱法 (SFC)。在手性化合物分离制备中,各种方法的应用根据其原理具有一定的局限性,如TLC 为正相色谱导致其分离能力有限,GC 则易对热不稳定化合物造成不可逆的损失,HPCE 的样品溶解性有限,而HPLC 用于分离制备需要大量的有机溶剂等;因此专家一直致力于更适合手性分离的色谱技术研究,而 SFC 以其分析速度快、分离度好、载样量高、有机溶剂使用量少的优势成为手性药物拆分制备的首选方法。 

凭借多年成功的 HPLC 分离制备系统研发经验,Sepiatec 公司推出了最新的 Prep SFC 100 超临界快速分离制备系统,为手性药物分离提供最理想的解决方案。

Sepiatec 制备分离技术

德国 Sepiatec 的 Prep SFC 100 制备系统充分展现了 SFC 技术”高效、节能、环保”的优势,同时兼具小型台式机体的紧凑设计和 Sepiatec 自主研发用户友好型的控制软件,并且突破了一般 SFC 系统的技术瓶颈,具体内容如下表所示:

传统 SFC 系统的局限性Sepiatec Prep SFC 100 系统特点
系统压力易波动稳健的背压调节器设计,使系统即便是在高强度的工作频率下亦能实现高精度的背压控制
改性剂需离线制备可在线自动混合不同比例的溶剂,实现高精度的溶剂输出,从而提高分离制备的时效性、精密度及重现性
样品制备回收率低专业设计的气液分离器,即便是在低有机溶剂比例 (约 5%) 的极限分离条件下,回收率仍可达到 95% 以上
工作流程

     

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案例
 
以下是由 Sepiatec Prep SFC 100 进行手性化合物反-二苯乙烯氧化物 (Trans-Stilbene Oxide) TSO 叠加进样的分离制备应用实例 。实验条件参数如表 1 所示。

表1. TSO 分离制备实验条件参数

项目参数
流动相CO2 / Methanol 70:30
流速80mL/min
色谱柱Reprosil Chiral NR, 8µm, 250 x 20mm (Dr. Maisch GmbH)
柱温箱温度40℃
背压150bar
检测波长UV 235nm
样品50mg TSO/mL
进样体积200μL
叠加进样次数15
叠加时间1.3 min

叠加进样是 SFC 实现快速分离的特有方式,可有效节省大量的分离制备时间。通常情况下样品制备的进样次数都在 20 – 50 次,叠加时间视分离色谱条件而定 1 – 5 分钟不等,保守计算最多可以节省 4 小时。图 1 展示的便是 TSO 样品分离制备的总运行色谱图,通过叠加平衡时间 1.3 分钟,叠加进样 15 次,可累计节省制备时间 19.5 分钟。

对于 SFC 分离制备系统,除高效要求外,连续分离制备运作系统的”重复性”也是仪器系统评价的重要指标之一。图 2 展示的即是 TSO 样品分离制备进样 15 次,每次所得到的分离色谱图的重叠效果图,可以看出 Prep SFC 100 分离制备系统优良的重现性和稳定性。同时这里也辅以数据说明系统的分离制备效果,具体实验结果如表 2 所示:分离制备测试样品 TSO,色谱峰 1 制备得到 48.9mg (回收率 97.2%),色谱峰 2 制备得到48.6mg (回收率 96.4%),两个化合物的 HPLC-UV 纯度检测结果均达到 99% 以上。

图 1. TSO 样品的叠加进样 — 总运行图

图 2. TSO 样品 的叠加进样 — 重复性叠加图

 

表2. TSO 手性分离制备实验结果

样品总量100.6mg TSO
总运行时间21 min
CO2 消耗量1,176mL
甲醇消耗量504mL
 色谱峰 1色谱峰 2
重量48.9mg48.5mg
回收率97.2%96.4%
纯度(HPLC – UV)99.97%99.93%
HPLC 色谱图
质谱检测选项

Sepiatec Prep SFC 100 可选配 Advion 公司生产的高性能紧凑型质谱仪 (expression CMS),内置有全面的 Prep SFC 100 及 MS 集成软件,可用于馏分的质谱检测,通过输入目标化合物的分子量而直接进行筛选分离。该选项可应用于目标手性化合物在混合物中的快速分离制备 (图 3)。

图3. Prep SFC 100 分离制备系统与 Advion 质谱检测器联用得到的 TIC (总离子流色谱图)、XIC (提取离子流色谱图) 和 UV 紫外信号色谱图

工作站
  • Sepiatec Prep SFC 100

结论

Sepiatec Prep SFC 100 制备分离系统可以应用于其他各种类型化合物的快速制备分离,如天然产物、合成产物与副产物,以及热敏不稳定物质等。大量应用结果显示,Prep SFC 100 制备分离系统快速高效、回收率高、重现性好,可满足科研、生产及质量控制等各方面的应用需求。

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